第一單元 基因工程
【重難點突破】
一、如何理解基因工程的概念和原理
1、操作環境是生物體外，典型過程是基因表達載體的構建。
2、基因工程的優點
（1）克服了遠緣雜交不親和的障礙。基因工程和植物體細胞雜交一樣，突破了有性生殖的局限。
（2）定向改造了生物性狀。與誘變育種相比較克服了誘變育種的突變的不定向性。
3、原理是基因重組。
4、操作層次：是分子水平。是獲取某生物的DNA分子片段，把它與另一個DNA分子片段結合成一個DNA分子。
5、實質：A種生物的某個基因通過一定方式導入B種生物體內并能進行基因表達。基因沒有改變，蛋白質沒有改變，只是轉錄和翻譯吃場所發生改變。
6、目的基因和載體能夠形成重組DNA分子的基礎是
（1）物質組成相同，都是四種脫氧核苷酸組成。
（2）空間結構相同，都是規則的雙螺旋結構。
（3）結構和功能單位相同，基因是控制生物性狀的結構和功能單位。性狀都是蛋白質表現的。
（4）遵循的基因表達原則相同，基因表達包括了基因的復制，轉錄和翻譯，都遵循中心法則。
（5）遺傳密碼相同，所有生物共用一套遺傳密碼。
【典題演示】
1、（2011溫州十校）采用基因工程技術將人凝血因子基因導入山羊受精卵，培育出了轉基因羊。但是，人凝血因子只存在于該轉基因羊的乳汁中。以下有關敘述，正確的是（ ）
A．如果人凝血因子基因的核苷酸序列已知，可用人工合成的方法獲得該目的基因
B．人體細胞中凝血因子基因進入羊受精卵細胞后，其傳遞和表達不再遵循中心法則
C．在該轉基因羊體內，人凝血因子基因存在于乳腺細胞，而不存在于其他體細胞中
D．人凝血因子基因開始轉錄后，DNA聚合酶以DNA分子的一條鏈為模板合成mRNA
【答案】A
【解析】掌握基因工程的原理是突破口。當已知某種基因的核苷酸序列，可以進行人工合成；目的基因的表達仍然遵循中心法則；由于目的基因是導入受精卵，所有體細胞都含有目的基因，只有在乳腺細胞中表達，是因為目的基因連接了乳蛋白的基因的啟動子；轉錄需要的酶是RNA聚合酶。
【變式訓練1】
1、（2010臨沂一模）轉基因植物是通過基因工程擁有其他物種基因即外源基因的植物。下列有關敘述中，正確的是（ ）
A．外源基因就是目的基因
B．外源基因的遺傳都遵循孟德爾遺傳定律
C．基因工程中的運載體質粒是細胞核內能夠復制的DNA分子
D．通過基因工程，植物細胞也能合成某些細菌的蛋白質
【答案】D
【解析】掌握目的基因和外源基因的關系是突破口。把插入到載體內的那個特定的片段基因稱為外源基因，而將那些已被或者準備要被分離，表達的特定基因稱為目的基因。外源基因針對受體生物而言是受體生物不具有的基因，目的基因是針對人的需要而言。外源基因如果存在線粒體、葉綠體、質粒或者原核細胞的DNA上是不遵循孟德爾的遺傳規律的；質粒是存在細胞質的環狀DNA；棉花的抗蟲基因的表達證明植物細胞也能合成某些細菌的蛋白質。
【變式訓練2】、（2010蘇北四市三模）下列過程一定能夠導致DNA分子結構發生改變的是
A．基因工程 B．DNA分子擴增 C．染色體變異 D．交叉互換
【答案】A
【解析】正確掌握影響DNA分子結構的因素和方式是突破口。DNA分子擴增是以DNA分子作為單位，進行半保留復制增加DNA分子數目；染色體的變異和交叉互換是發生在基因數量或者位置的改變，并沒有影響DNA分子內部；只有基因工程是在一個DNA分子內部插入了另外一個DNA分子的片段。
【變式訓練3】、（2010蘇州中學）（多選）下列關于基因工程的敘述，正確的是
A.目的基因和受體細胞均可來自動物、植物或微生物
B.限制性核酸內切酶和DNA連接酶是兩類常用的工具酶
C.人胰島素原基因在大腸桿菌中表達的胰島素原有生物活性
D.載體上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細胞和促進目的基因的表達
【答案】AB
二、基因工程操作常用的工具有哪些？
1、限制酶又稱限制性核酸內切酶
（1）化學本質 ：蛋白質
（2）來源：主要來源于原核生物，是原核生物切斷入侵細胞內外源DNA的保護自身的工具。
（3）作用：具有酶的共性催化作用外還用于對DNA分子的切割獲取目的基因和對載體的切割。
（4）特異性，能夠識別特定的脫氧核苷酸序列，并有特定的切割位點。切割的化學鍵叫磷酸二酯鍵。
切割目的基因和載體時要用同一中限制酶。
（5）切割的結果有兩種分別是粘性末端和平末端。
2、DNA連接酶
（1）種類：E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。
（2）作用：是連接兩個DNA片段形成磷酸二酯鍵。
（3）適用對象：E.coliDNA連接酶是連接粘性末端，T4DNA連接酶是連接粘性末端和平末端。
（4）與DNA聚合酶的比較：相同點都可以形成磷酸二酯鍵；不同點是DNA連接酶是連接DNA片段形成重組DNA分子，DNA聚合酶是把游離的脫氧核苷酸按照堿基互補配對原則，連接在一條脫氧核苷酸鏈上形成新的DNA分子。
3、載體
（1）常用載體是質粒，本質是小型環狀DNA；其他載體有λ噬菌體的衍生物、動植物病毒等。
（2）功能：將目的基因導入受體細胞。
（3）載體必需具備的條件：能夠在宿主細胞內穩定保存并大量復制；有一個至多個限制酶的切割位點，以便于與外源基因進行連接；有特殊的遺傳標記基因，供重組DNA的檢測和鑒定。
（4）特別注意：①現在使用的載體多是人工改造的；②常見的標記基因有抗生素抗性基因、發光基因和產生特點顏色的表達產物基因等；③質粒可以在自身細胞、受體細胞或者體外環境都可以進行自我復制；④載體上最好是每種酶的切點只有一個；⑤細胞膜上的載體是蛋白質，具有運輸作用。
【典題演示2】
1、 (2010無錫高三)基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和質粒，便于重組和篩選。已知限制酶I的識別序列和切點是?C↓GATCC?限制酶Ⅱ的識別序列和切點是?↓GATC?。根據圖示判斷下列操作正確的是（ ）
A.目的基因和質粒均用限制酶Ⅱ切割
B.目的基因和質粒用限制酶I切割
C.質粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶I切割
D.質粒用限制酶I切割，甘的基因用限制酶Ⅱ切割
【變式訓練4】
1、下列有關DNA聚合酶鏈式反應的說法正確的是（ ）
A．需要引物 B．始終在高于70℃的條件下進行
C．需要加DNA連接酶 D．需要加熱穩定DNA聚合酶
【變式訓練5】、已知某種限制性內切酶在一線性DNA分子上有3個酶切位點，如圖中箭頭所指，如果該線性DNA分子在3個酶切位點上都被該酶切斷，則會產生a、b、c、d四種不同長度的DNA片段。現在多個上述線性DNA分子，若在每個DNA分子上至少有1個酶切位點被該酶切斷，則從理論上講，經該酶切后，這些線性DNA分子最多能產生長度不同的DNA片段種類數是
A.3 B.4 C.9 D.12
【變式訓練6】、2008年諾貝爾化學獎授予了“發現和發展了水母綠色熒光蛋白“的三位科學家。將綠色熒光蛋白基因的片段與目的基因連接起來組成一個融合基因，再將該融合基因轉入真核生物細胞內，表達出的蛋白質就會帶有綠色熒光。綠色熒光蛋白在該研究中的主要作用是
A．追蹤目的基因在細胞內的復制過程
B．追蹤目的基因插入到染色體上的位置
C．追蹤目的基因編碼的蛋白質在細胞內的分布
D．追蹤目的基因編碼的蛋白質的空間結構
三 基因工程的操作程序有哪些？
1、目的基因的獲取
技術：限制酶切割?切割出粘性末端和平末端。
（1）從基因文庫中獲取目的基因；
文庫類型cDNA文庫基因組文庫
文庫大小小大
基因中的啟動子無有
基因的多少某種生物的部分基因某種生物的全部基因
物種之間的基因交流可以部分基因可以
說明基因文庫的組建過程包含了基因工程的操作過程。從基因文庫獲取目的基因的優點是操作簡便；缺點是工作量大，具有一定的盲目性。
（2）利用PCR技術擴增目的基因；
PCR技術DNA復制
相
同
點原理DNA復制（堿基互補配對原則）
原料四種游離脫氧核苷酸
條件模板、ATP、酶、原料、引物
不
同
點解旋方式DNA在高溫下解旋解旋酶催化
場所體外復制主要在細胞核內
酶Taq酶細胞內的DNA聚合酶
結果短時間內形成大量的DNA片段形成整個DNA分子
（3）人工合成。常見的有反轉錄法和氨基酸序列合成法兩種。
①反轉錄法 是在核糖體合成多肽的旺盛時期，首先把含有目的基因的mRNA的多聚核糖體提取出來，分離出mRNA，然后以mRNA為模板，用反轉錄酶合成一個互補的DNA，即cDNA單鏈，再以此單鏈為模板合成出互補鏈，就成為雙鏈DNA分子。這種方法專一性強，但是操作過程比較麻煩，特別是mRNA很不穩定、生存時間短，所以要求的技術條件較高。
②氨基酸序列合成法是建立在DNA序列分析基礎上的。當把一個基因的核苷酸序列搞清楚后，可以按圖紙先合成一個個含少量（10～15個）核苷酸的DNA片段，再利用堿基對互補的關系使它們形成雙鏈片段，然后用連接酶把雙鏈片段逐個按順序連接起來，使雙鏈逐漸加長，最后得到一個完整的基因。這種方法專一性最強，現在用計算機自動控制的DNA合成儀，進行基因合成，使基因合成的效率大大提高。但是這種方法目前僅限于合成核苷酸對較少的一些簡單基因，而且必須事先把它們的核苷酸序列搞清楚。對于許多復雜的、目前尚不知道核苷酸序列的基因就不能用這種方法合成，只能用前兩種方法或其他方法分離或合成。這種合成基因的方法還有一個很大的優點，就是可以人工合成自然界不存在的新基因，使生物產生新的性狀以滿足人類需求。因此，這一方法今后將隨著技術的不斷改進而得到越來越廣泛的應用。
2、基因表達載體的構建是基因工程的核心步驟。
（1）基因表達載體的結構組成：
啟動子是啟動轉錄的DNA片段；終止子是終止轉錄的DNA片段；目的基因；抗生素抗性基因是標記基因；復制原點DNA的復制有特定的起始位點。
（2）技術：應用DNA連接酶連接末端。
3、將目的基因導入受體細胞
（1）導入雙子葉植物一般用農桿菌轉化法；農桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數雙子葉植物的受傷部位(受傷處的細胞會分泌大量酚類化合物,從而使農桿菌移向這些細胞)，并誘導產生冠癭瘤或發狀根。
根癌農桿菌和發根農桿菌中細胞中分別含有Ti質粒和Ri質粒，其上有一段T-DNA，農桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中,并且可以通過減數分裂穩定的遺傳給后代，這一特性成為農桿菌介導法植物轉基因的理論基礎。
我們將目的基因插入到經過改造的T-DNA區，借助農桿菌的感染實現外源基因向植物細胞的轉移與整合，然后通過細胞和組織培養技術，再生出轉基因植株。農桿菌介導法起初只被用于雙子葉植物中，近年來，農桿菌介導轉化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得到了廣泛應用。
（2）棉花用花粉管通道法；亦稱受粉后外源基因導入植物的技術，是利用植物受粉后所形成的天然花粉管通道（花粉引導組織），經珠心通道將外源DNA攜帶進入胚囊，轉化受精卵或其前后的生殖細胞（精子、卵子），由于它們仍處于未形成細胞壁的類似"原生質體"狀態，并且正在進行活躍的DNA復制、分離和重組，所以很容易將外源DNA片段整合進受體基因組中，以達遺傳轉化的目的。
在雙受精過程完成后，受精卵細胞的初次分裂需要充分的物質和能量積累。此時期的細胞尚不具備完整垢細胞壁和核膜系統，細胞內外的物質交流頻繁。通過花粉管通道途徑滲透進入胚囊的轉基因片段就有可能被吸入受精卵細胞，并進一步地通過尚不明確的機理被整合進入受體基因組中。
（3）單子葉植物基因槍法；
（4）導入動物細胞用顯微注射法；在顯微鏡下，用一根極細的玻璃針(直徑1～2微米)直接將DNA注射到胚胎的細胞核內，再把注射過DNA的胚胎移植到動物體內，使之發育成正常的幼仔，使用這種方法進行外源基因整合成功率約為10％。
（5）導入微生物細胞，用Ca2+處理成為感受態細胞。在CaCl2溶液中，細菌細胞會發生膨脹，同時Ca2+會使細胞膜磷脂雙分子層形成液晶結構，促使細胞外膜與內膜間隙中的部分核酸酶解離開來，離開所在區域，誘導細胞成為感受態細胞
同時Ca2+能與加入的DNA分子結合，形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基－磷酸鈣復合物，并粘附在細菌細胞膜的外表面上。當42度熱刺激短暫處理細菌細胞時，細胞膜的液晶結構會發生劇烈擾動，并隨機出現許多間隙，為DNA分子提供進入細胞的通道。
總的來說就是細胞在低溫Ca2+等因子誘導下,細胞膜通透性發生改變,膜通透性的改變使細胞可以攝取DNA。
（2）特點：四個步驟中唯一不涉及堿基互補配對的。選用微生物作為受體細胞的理由是個體微小，代謝旺盛，繁殖速度快，獲得的目的基因產物多。
4、目的基因的檢測和鑒定
（1）分子水平的檢測：利用DNA分子雜交法檢測目的基因及其產物mRN；用抗原?抗體雜交檢驗目的基因的蛋白質產物；檢測結果看是否出現雜交帶。
（2）個體水平檢測。
【典題演示3】
1、（2010浙江）在用基因工程技術構建抗除草劑的轉基因煙草過程中，下列操作錯誤的是（ ）
A.用限制性核酸內切酶切割煙草茶葉病毒的核酸
B.用DNA連接酶連接經切割的抗除草劑基因和載體
C.將重組DNA分子導入原生質體
D.用含除草劑的培養基篩選轉基因煙草細胞
【答案】A
【解析】本題考查基因工程的有關知識，基因工程的一般過程：①用限制性核酸內切酶切割含目的基因的DNA分子（除草劑基因）和運載體（質粒），②用DNA連接酶連接切割好的目的基因和運載體③重組DNA分子導入受體細胞，因為是植物可以說是原生質體④用相應的試劑和病原體帥選轉基因細胞⑤用植物組織培養技術抗除草劑的轉基因煙草（表達）。
【變式訓練7】
1、（2010江蘇）下列關于轉基因植物的敘述。正確的是
A．轉入到油菜的抗除草劑基因，可能通過花粉傳人環境中
B．轉抗蟲基因的植物．不會導致昆蟲群體抗性基因擷宰增加
C．動物的生長激素基因轉人植物后不能表達
D．如轉基因植物的外源基因來源于自然界，則不存在安全性問題
【答案】A
【解析】本題考查了轉基因技術的安全性問題。轉入到油菜的基因，可以通過花粉傳入環境中；由于植物與害蟲間是相互選擇的，轉抗蟲基因植物可使昆蟲群體抗性基因頻率增加；動物生長素基因轉入植物后也能表達；轉基因技術的安全性問題，要通過驗證才能得到證實。
【變式訓練8】、（2009上海理綜）科學家運用基因工程技術將人胰島素基因與大腸桿菌的質粒DNA分子重組，并且在大腸桿菌體內獲得成功表達。圖示a處為胰島素基因與大腸桿菌質粒DNA結合的位置，它們彼此能結合的依據是
A．基因自由組合定律 B．半保留復制原則
C．基因分離定律 D．堿基互補配對原則
【答案】D
【解析】本題考查基因工程的相關知識，重組質粒依據的是粘性末端的堿基互補配對原則。
【變式訓練9】、（2009廣東理基）錢永健先生因在研究綠色熒光蛋白方面的杰出成就而獲2008年諾貝爾獎。在某種生物中檢測不到綠色熒光，將水母綠色熒光蛋白基因轉入該生物體內后，結果可以檢測到綠色熒光。由此可知
A．該生物的基因型是雜合的
B．該生物與水母有很近的親緣關系
C．綠色熒光蛋白基因在該生物體內得到了表達
D．改變綠色熒光蛋白基因的1個核苷酸對，就不能檢測到綠色熒光
【答案】C
【解析】某種生物中檢測不到綠色熒光，將水母綠色熒光蛋白基因轉入該生物體內后，結果可以檢測到綠色熒光，說明綠色熒光蛋白基因在該生物體內得到了表達。
四、基因工程和蛋白質工程有哪些實際應用？
1、轉基因植物：
（1）抗蟲轉基因植物：用于殺蟲的基因主要是Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、植物凝集素基因。
（2）抗病轉基因植物：抗病毒植物使用最多的病毒外殼蛋白基因和病毒復制酶基因；抗真菌轉基因使用幾丁質酶基因和抗毒素合成基因。
（3）其他抗逆轉基因植物 導入調節滲透壓的基因；魚的抗凍蛋白基因；抗除草劑基因。
2、轉基因動物
（1）導入外源生長素基因可以提高動物生長速度
（2）導入腸乳糖酶基因，改善奶牛的牛奶品質
（3）導入血清白蛋白等基因可以用轉基因動物生產藥物
（4）用轉基因動物作器官移植的供體
3、蛋白質工程
【典題演示4】
（2010全國2）下列敘述符合基因工程概念的是
A．B淋巴細胞與腫瘤細胞融合，雜交瘤細胞中含有B淋巴細胞中的抗體基因
B．將人的干擾素基因重組到質粒后導入大腸桿菌，獲得能產生人干擾素的菌株
C．用紫外線照射青霉菌，使其DNA發生改變，通過篩選獲得青霉素高產菌株
D．自然界中天然存在的噬菌體自行感染細菌后其DNA整合到細菌DNA上
【答案】B
【解析】 B淋巴細胞與腫瘤細胞融合，雜交瘤細胞中含有B淋巴細胞中的抗體基因屬于動物細胞工程的內容；用紫外線照射青霉菌，使其DNA發生改變，通過篩選獲得青霉素高產菌株
屬于微生物的發酵工程的內容；自然狀態下，一般不能自行形成重組DNA分子。
【總結提升】
兩種工具酶，三種工具，四步操作。
本文來自：逍遙右腦記憶 http://www.lg566.com/gaosan/78519.html
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